食管癌被认为是全世界癌症死亡的第六个主要原因，差5年生存率低于20％（1,2）。食管鳞状细胞癌（ESCC）是世界上食管癌的主要形式（3-5）。在中国，它排名估计的癌症死亡（6）。手术治疗可以大大提高早期ESCC的存活率。不幸的是，大多数ESCC患者被诊断出在先进的阶段，进展快速，预后差（7）。因此，迫切希望了解ESCC如何进展以改善其临床结果。DNA聚合酶IOTA（POLI）属于Y家族DNA聚合酶，并参与翻塑DNA合成（TLS）（8）。PolI（Poli基因的产品）被鉴定为人（9）中的酵母Rad30基因的第二同源物。尽管POLI识别出于其在复制期间绕过DNA病变的功能（8），但最近的研究表明POLI涉及各种类型的癌症的进展。在乳腺癌（10,11），膀胱癌（12），胶质瘤（13）和ESCC（14）中发现过表达。此外，升高的POLI激活ERK和JNK信号通路，有助于侵袭，转移和ESCC预后差（15,16）。但是，PolI是否在ESCC增殖中发挥作用仍然不明确。快速癌症进展期间的主要过剂的代谢途径之一是戊糖磷酸途径（PPP），其调节核苷酸结构组分核糖-5-磷酸核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（NADPH）（17-19）的生产。PPP的激活使肿瘤细胞具有增殖和发育的优势（20-22）。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）用作PPP的起搏器，由于其活性向PPP分流葡萄糖通量并催化PPP（17）的第一和速率限制步骤。安装证据表明，在许多癌症类型中，G6PD的PPP和过度激活的增加的葡萄糖通量在许多癌症类型中是常见的，包括透明细胞肾细胞癌，肝细胞癌，结肠直肠癌，前列腺癌和ESCC（23-27）。众所周知，在转录或后期性水平（17,21,22,27-29）中调节肿瘤细胞的G6PD过剂。最近的证据表明OGT促进了G6PD的O-GlcnaCylation，并且该方法对于G6PD活化和肿瘤进展至关重要（30）至关重要。但是，它仍然不明确G6PD和PPP在ESCC中过度激活，并对PLI是否参与其调节，G6PD和PPP如何。在本研究中，发现POLI促进ESCC增殖，由激活的G6PD重定向葡萄糖通量朝PPP中产生。机械地，我们发现POLI通过ERK-OGT诱导的O-GlcNacyation激活G6PD。这部小说发现以及之前的报告（14-16）表示PolI是潜在的新生物标志物和ESCC的治疗目标。
结果
PoliPromotesESCCColonyFormationandCellProliferationInVitro
研究POLI对ESCC细胞增殖的影响，在本研究中使用POLI过表达TE-1细胞和下调的KYSE细胞。通过蛋白质印迹确认这些细胞系中POLI的表达（图1A，C）。然后，我们对这些细胞进行了菌落形成测定和EDU掺入测定。菌落形成测定的结果表明，与对照组相比，POLI过度表达强化了TE-1和Kyse-细胞的克隆因能力（图1B，D）。在EDU掺入测定中观察到类似的结果。如图1E所示，与对照细胞相比，POLI的过表达增强了TE-1细胞的增殖（P0.01），而仅在POLI中掺入的EDU的一半下调Kyse-细胞。占据，这些结果表明，POLI促进ESCC细胞群形成和增殖。
PoliInducesMetabolicTransitionbyEnhancingG6PDActivity为推出POLI诱导ESCC细胞增殖的潜在机制，基因设定富集分析（GSEA，V4.1.0，MSIGDB7.2）（31,32）是重新分析我们的转录组数据（15）在POLI下调Kyse-ShpolI细胞与控制Kyse-SHNC细胞。如图2A所示，许多上调基因富集在氧化磷酸化途径中，包括NADH脱氢酶（DUFA）的亚基，泛醌氧化还原酶和细胞色素C氧化酶（图2B）。另一方面，许多下调基因涉及其他代谢途径，例如糖酵解或脂质代谢。值得注意的是，在Kyse-ShpolI细胞中，发现核酸N-乙酰葡糖胺（GLCNAC）转移酶（OGT），G6PD活性的关键调节剂（图2B）下调。我们接下来应用细胞代谢率分析来评估是否在PolIknocking诱导的氧化磷酸化相关基因的上调突出中触发了代谢转变。正如预期的那样，Kyse-ShpolI细胞表现出更高的氧化磷酸化能力，与对照细胞相比（图2C）。此外，细胞代谢率分析还表明，氧化磷酸化是相似的，但在PolI上调细胞中不降低与对照细胞（图S1）。这些结果表明，POLI可能在葡萄糖通量的定向控制中发挥关键作用。考虑到G6PD，PPP的速率限制酶，在葡萄糖通量重定向和癌细胞增殖中，我们在POLI差异表达ESCC细胞系中评估其活性。如图2D所示，在POLI上调TE-1细胞中，G6PD的酶活性比对照细胞高出2.5倍。相反，当PolI被击倒在Kyse-细胞时，它的活动将降至约75％。注意，在我们的后续研究中，我们发现G6PD的蛋白质水平没有变化（图3B）。始终如一地，细胞NADPH浓度显示出类似的图案，其在TE-1POLI细胞中跳至约％，同时在Kyse-shpolI细胞中下降约50％（图2E）。这些结果表明，POLI通过G6PD激活引导葡萄糖通量至PPP。
PoliPromotesG6PDO-GlcNAcylationandOveractivation
Poli的过度表达增加和下调POLI的下调降低了G6PD的O-GlcNAcylation，表明OGT诱导G6PD的O-GlcNAcylation通过PolI调节。WE进一步评估了使用双荧光素酶报告结果测定的OGT启动子活性，发现在POLI过表达的TE-1细胞中显着增加了OGT启动子活性，并在POLI下调Kyse-细胞（图3D）中减少（图3D）。我们还测试了IHC的患者组织中POLI，OGTANDOGlcNacylation的表达。PolI和OGT阳性染色主要存在于细胞质中，而在核和细胞质中发现O-Glcnacylation阳性染色（图3e）。肿瘤组织的OGT和蛋白质O-GlcNacylation的水平显着高于相邻组织中的肿瘤组织（图3F）。进一步分析了基于IHC得分的PolI，OGT和O-Glcnacy的相关性。如图3G所示，POLI表达与OGT的表达呈正相关（r=0.48，p0.）。类似地，OGT表达也与O-Glcnacylation的水平呈正相关（r=0.43，p0.）。
然后，我们应用Kaplan-Meier生存率分析，发现患有较高水平的O-Glcnacylation的患者表现出差的预后差（p=0.，图3h）。在一起，这些数据显示，POLI引起OGT表达以促进G6PDO-Glcnacylation和活化。此外，升高的O-Glcnacylation与增加的肿瘤大小和患者预后差相关。
PoliModulatesOGTExpressionThroughtheErkSignalingPathway
据报道，ERK信号通路负责OGT（33）的转录调节。因此，我们评估了ERK在POLI监管OGT转录中的作用。符合我们之前的研究，PolI的过度表达增强和敲击POLI的敲低我削弱ERK的磷酸化（图4A）。随后，我们使用特异性抑制剂PD抑制PolI过表达TE-1细胞系中的ERK磷酸化。如图4B所示，PD以浓度依赖性方式抑制ERK磷酸化，并降低OGT蛋白表达。此外，抑制的ERK磷酸化与POLI过表达的TE-1细胞系中的OGTmRNA表达（图4c）和OGT启动子活性（图4D）相关。总的来说，这些发现表明OGT表达由POLI-ERK信号传导级联调节。
InhibitionofG6PDActivityAttenuatesPoli-InducedCellProliferation
我们进一步测试了PolI和G6PD活化在体内ESCC细胞增殖中的作用。将TE-1NC和TE-1POLI细胞皮下注射到雌性裸鼠中。对于药物治疗，每隔一天在平均肿瘤大小长达mm3后，每隔一天腹腔内注射5mg/kg多角菌。对照组中的小鼠施用相同体积的正常盐水。如图6A所示，POLI的强制表达促进了与对照TE-1细胞相比的TE-1POLI细胞中的肿瘤生长，而多边素治疗显着抑制TE-1细胞的POLI诱导的增殖。进一步的酶活性测定证实通过肿瘤组织中的多达肽抑制G6PD（图6B）。然后我们进行IHC验证OGT和O-Glcnacylation的表达。如图6C所示，具有伴随与PolI过度表达的OGT和OGLCNAcylation的伴随升级趋势是显而易见的。这些结果表明，G6PD活性对于体内PolI促进的ESCC细胞增殖至关重要。
DISCUSSION
G6PD的激活在癌症增殖和进展中起着枢轴作用。它将葡萄糖助焊剂分流为PPP，以满足核糖-5-磷酸酯和NADPH（17,18）的需求。在本研究中，发现POLI通过激活G6PD来促进ESCC增殖。POLI通过OGT介导的G6PD激活G6PD的G6PDO-GlcnaCation，并且特异性抑制剂多达汀的G6PD活性抑制在体外和体内抑制POLI促进的ESCC细胞增殖。我们的研究结果表明，POL我在ESCC增殖和进展中发挥着关键作用。几种证据表明，通过重定向葡萄糖助焊剂，G6PD是PolI-ProdedESCC细胞增殖中的关键效应。首先，GSEA和Seahorse分析仪的结果证明，在Kyse-细胞中，POLI下调触发增加的氧化磷酸化，以前据报道妨碍葡萄糖代谢和肿瘤细胞增殖（18）。此外，在Kyse-shpolI细胞中降低了G6PD活性和细胞NADPH浓度。这些结果表明，在POLI下调后，由于G6PD去激活，葡萄糖助焊剂朝向氧化磷酸化。其次，POLI上调在TE-1细胞中导致增强的G6PD活性和细胞NADPH浓度，表明葡萄糖通量增强到PPP中。第三，用多边蛋白的处理，G6PD的特异性抑制剂（34-36），抑制体外和体内促进的POLI促进的ESCC细胞增殖。这些结果表明，G6PD活性对于PolI促进的ESCC增殖至关重要。肿瘤细胞中的G6PD过剂在转录或后期性水平（17,21,22,27-29）处受到调节。如图3B所示，在POLI差异表达细胞中，G6PD的表达保持不变，表明后期改变的改性可以负责G6PD活化，例如OGT诱导的O-Glcnacylation（30）。与此假设一致，POLI上调增强，POLI下调在我们的ESCC模型系统中衰减G6PDO-Glcnylation。已知O-Glcnacylation通过增强NADP+与G6PD的结合而激活G6PD并促进低聚G6PD的形成，导致朝向PPP（30）的葡萄糖通量增加。因此，增强细胞增殖和肿瘤进展（17,19,29,30）。因此，我们的数据表明，通过Og诱导O-Glcnacylation的G6PD激活促进ESCC增殖。OGT促进蛋白质O-Glcnacylation（37,38），并且已发现在大多数癌症中被上调（包括ESCC（39,40）。在本研究中，我们发现总oglcNacylation水平与OGT表达和患者预后差（R=0.43，图3F，G）相关。有助于OGT过表达的关键调节器之一是癌症中的过度活跃的ERK信号级联（33）。ERK途径在大约三分之一的人类癌症中解毒，是有助于癌症增殖的关键信号传导途径之一（32）。据报道，DNA聚合酶IOTA（POLI）可以与P53（41,42）相互作用，该P53（41,42）调节ERK信号通路（43-45）。因此，可以通过DNA损伤修复系统通过POLI激活ERK信号通路。因此，我们假设升高的OGT可能由ESCC（14）中的POLI过度表达导致。我们的结果表明，POLI的表达与ESCC细胞和患者样品中OGT的表达呈正相关（R=0.48，图3F）。此外，POLI耦合ERK信号传导增强了可以通过PD，MEK信号传导特异性抑制剂（46）抑制的OGT启动子活性。已经定义了四个MEK激活MAPK瀑布：ERK1/2，CjunN末端激酶（JNK），P38MAPK和ERK5（47,48）。据报道，MEK抑制剂PD对JNK（49）ANDP38（50）的活化没有影响。否则，证据建议PD抑制ERK1/2和ERK5路径（51）。然而，它是ERK1/2，但不是ERK5激活的elk-1转录活性（52），据报道介导ERK信号传导诱导的OGT表达（33）。因此，在我们的研究中，PD诱导OGT下调主要是由于其ERK1/2级联的抑制作用。因此，我们的研究结果表明，POLI通过ERK信号级联增强OGT表达。然而，在POLI调节ESCC细胞中的OGT表达的背景下，仍有一些研究差距来填补。首先，需要鉴定负责ERK诱导的ERK诱导的OGT表达的转录因子。其次，除了G6PD之外，还需要进一步审查凝结糖基化蛋白。将进行未来的研究，以完全了解POLI促进OGT过表达和蛋白质O-甘烷化的方法。总之，本研究结果表明，POLI通过ERK-OGT级联诱导的G6PD过度激活促进ESCC增殖。本研究提供了对ESCC增殖和进展的新颖洞察力，表明PolI是潜在的生物标志物和ESCC治疗目标。
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